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三个月前，河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文（F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016）。文章介绍了一种新型的基因编辑方法，迅速引起广泛关注。
然而，随着时间推移，研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。8月2日，《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。8月8日，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。
（新版实验方法全文，可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载）。
新版实验方法具体分为细胞培养、质粒/gDNA 共转染，以及基因组提取三个部分。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods（详见 http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information），新实验步骤有几处改变：
1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。
2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”的小提示。
3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后，补转一次 gDNA；旧版方法中只提及了“24小时”。
4 旧版方法中，溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0），而新方法中则变更为水（pH 8.0）。
最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中，EDTA 再次出现：其中一条注意事项专门提到，应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。这四条注意事项分别是：
1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。
2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子，在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。
3 转染试剂 Lipofectamine® 3000会阻碍 gDNA 进入细胞，不能用于转染。可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。其他转染试剂是否可用还有待验证。
4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理，处理体系如下：（体系略）处理后的 gDNA 无需再次纯化，直接用水（pH 8.0）稀释至300 μl，终浓度10 nM。
（高山）
据说韩春雨公开了武功秘籍 |
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