上海生科院应用优化的CRISPR技术建立基因完全敲除的小鼠及猴

摘要: 　　6月6日，细胞学习在线发表了一项成果，应用改进的“C-CRISPR”技术可以获得单基因或多基因功能完全敲除的小鼠及猴。这项学习由中国科学院上海生命科学学习院神经科学学习所、脑科学与智能技术卓越创新中心的杨辉 ...

　　6月6日，细胞学习在线发表了一项成果，应用改进的“C-CRISPR”技术可以获得单基因或多基因功能完全敲除的小鼠及猴。这项学习由中国科学院上海生命科学学习院神经科学学习所、脑科学与智能技术卓越创新中心的杨辉学习组、熊志奇学习组以及神经所苏州非人灵长类学习平台孙强团队合作完成。该学习通过将多个针对基因外显子的连续指导RNA（sgRNA）注射到受精卵中，可以高通量制作各种基因完全敲除小鼠并用于表型分析，并快速制作基因敲除猴模型。
　　CRISPR/Cas9系统是一种非常高效的基因编辑方法，但是大局部被基因编辑过的动物都有嵌合性，也就是说它们只有一局部细胞的基因发生了编辑。对于涉及表型的学习而言，嵌合的基因编辑动物需要进一步杂交育种，才能得到完全的基因敲除动物。当涉及大型动物，比方说非人灵长类时，嵌合体的问题就会显得尤为严重，因为猕猴的繁殖周期长达5-6年而且每胎只生一个幼崽。之前有许多学习者都试图一步法来产生没有嵌合的基因修饰动物，尤其是大型动物。包括将Cas9 mRNA和sgRNA注射到卵母细胞中而非受精卵中，或注射Cas9蛋白，或注射双sgRNA。但是DNA测序分析了这些方法的动物个体组织后，发现这些方法完全做到双等位基因敲除的效率相当低。
　　这项学习中，学习者发现向受精卵当中注射Cas9 mRNA和多个sgRNA的鸡尾酒式混合物，单个或多个基因在小鼠胚胎能做到100%的完全删除，以及猴子胚胎中91%-100%的删除。这种方法能同时产生插入缺失和外显子删除，从而实现高效的基因完全敲除。学习者还应用C-CRISPR法建立基因功能完全敲除的F0代小鼠，用于基因功能的快速表型分析，以及获得基因功能完全敲除的F0代猴。最后，通过高通量测序分析显示，C-CRISPR在基因编辑过的小鼠和猴子中不会引入明显的脱靶改变。
　　该项工作由博士后左二伟、助理学习员蔡毅君、博士后李奎、学习生魏瑜、博士后王邦安在灵长类疾病模型学习组学习员杨辉、疾病神经生物学学习组学习员熊志奇与苏州非人灵长类学习平台主任孙强的指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了上海生科院生物化学与细胞生物学学习所学习员李劲松、徐国良的大力协助，是众多课题组通力合作的重要成果。该工作得到中科院战略性先导科技专项(XDB02050007， XDA01010409)、国家高科技研发项目(863项目; 2015AA020307)、国家自然科学基金会(国家自然科学基金委资助31522037和31500825)、中国青年千人计划(杨辉)、中科院重大突破项目、上海青年科学人才培养计划(15YF1414700)、国家关键技术研发项目(2014BAI03B00，孙强)、上海市科学技术委员会项目 (16JC1420202，杨辉; 14140900100，孙强)、中科院百人计划(孙强)等项目的资助。

　　一步法获得基因完全敲除的小鼠和食蟹猴。A. 小鼠Tyr基因sgRNA靶向位点示意图。B.注射Cas9 mRNA合并多个毗邻的sgRNA进入小鼠受精卵。C.食蟹猴Prrt2基因sgRNA靶向位点示意图。D.MII卵子单精子注射发育到原核期受精卵，随后注射Cas9 mRNA合并多个毗邻的sgRNA。

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