科研入门之手把手教你做细胞免疫荧光

摘要: 　　小编最近在做细胞免疫荧光实验，也是磕磕碰碰遇到了好多问题，参考了网上相关资料，再结合自身实际情况，现在总结出如下简单明了的实验protocol，分享给大家。　　首先讲一下原理：免疫荧光技术（Immunofluoresc ...

　　小编最近在做细胞免疫荧光实验，也是磕磕碰碰遇到了好多问题，参考了网上相关资料，再结合自身实际情况，现在总结出如下简单明了的实验protocol，分享给大家。

　　首先讲一下原理：免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

　　正式进入操作步骤：
　　1.细胞铺板：将细胞以合适的密度（注意：一般情况下，细胞密度不要太高，不要叠在一起，否则干扰最后拍片）接种于玻底培养皿（b小编用的是confocal皿：如下图）中，进行转染，加药诱导等实验处理。

　　2.固定：吸去培养基，PBS清洗2次。3min/次。加4%的多聚甲醛(用1X的PBS稀释配制)，室温固定20-30min。PBS清洗3次，3-5min/次。吸干PBS。
　　3.通透：加0.3%-0.5%Triton X-100(用1X的PBS稀释配制)，室温通透20-30min（如果是检测细胞膜上表达的抗原，则省略此步骤）。PBS清洗3次，3-5min/次。吸干PBS。
　　4.封闭：在玻底培养皿中滴加正常血清或5%BSA封闭液，室温封闭30-60min；
　　5.孵育一抗：吸掉封闭液，不用PBS洗，在每个玻底培养皿中滴加足够量的稀释好的一抗，并放入湿盒，4℃孵育过夜；
　　注意：一般抗体稀释比约为1:50-1:100。正常玻底皿培养皿每皿加50-100ml抗体稀释液（至少要能恰好浸没住底部细胞）。还有必须保证湿盒有水，以免干片。一抗建议回收，放-20℃或-80℃保存。若是检测多个指标，所用一抗必须是不同来源。
　　6.孵育二抗：回收一抗，加0.1%的PBST 清洗3次，3-5min/次。吸干PBST。滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗3次，每次3min。
　　注意：该步骤及之后步骤都需要避光操作。二抗稀释倍数约为1:100-1:200。
　　7.复染核：滴加DAPI或Hochest孵育5-10min（避光操作），对样品进行染核，PBST 浸洗4次，每次5min。
　　8.拍片：在共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察采集图像。