基因编辑技术漫谈

 最近关于NgAgo的讨论激发了大家对于基因编辑技术的热情，这里简单介绍一下相关技术，不专业之处请方家指正。

CRISPR-Cas9技术自诞生以来，及大地便利了基因的改造和编辑，在各个实验室得到了非常广泛的应用。不过在其便利之后，CRISPR也有着固有的缺陷。它在寻找基因组特定位点并进行切割上表现非常理想，也适用于从细菌到哺乳动物细胞等不同的生物。但它存在两点非常重要的缺陷，一是需要在结合位点附近存在PAM序列，在进行实际应用时不可避免地带来一些限制；二是需要额外的引导RNA，而RNA本身并不稳定。

今年年初韩春雨老师对于NgAgo的发现是一个重要的进展，从研究者的热情中也可以看出现有CRISPR体系的不尽如人意。NgAgo仅仅是可能的基因编辑工具之一，让我们回顾下还有哪些新的技术：

更小的CRISPR

CRISPR-Cas9的一个潜在应用是用于重写患者体内的疾病基因。不过目前的基因疗法中采用的腺病毒载体只能搭载有限长度的片段（(~4.5kb）。目前主流使用的来自酿脓链球菌的Cas9酶（~4.2kb）加上RNA片段对于这些病毒来讲太大了，没法打包进去。一个解决方案是寻找更小的能够打包进去的Cas9酶。MIT的张峰还真在金黄葡萄球菌（臭名昭著的耐药菌）中找到了一个这样的酶[2]。去年12月，两个组成功地利用mini-Cas9纠正了老鼠中假肥大型肌营养不良症的相关基因。

更多选项

Cas9仅仅是一种能够操作DNA的酶，人们也在从不同物种，寻找具有不同序列特异性的蛋白。一个备选是Cpf1，它比Cas9小，而且特异性很高。不过从本质上讲Cpf1和Cas9没有什么太大区别，都是RNA诱导的DNA内切酶（RNA-guided endonuclease），主要的区别在于Cpf1不需要tracrRNA，而CRISPR需要crRNA以及tracrRNA（或者一条sgRNA）。另外Cpf1切割后产生黏性末端，而不像Cas9，产生平末端。另外一个备选的酶C2c2，它的靶标是RNA而不是DNA，是细菌抵御RNA噬菌体的武器（比如MS2噬菌体）。可以用来对RNA进行研究或者治疗RNA病毒带来的疾病。

基因编辑

很多组利用CRISPR技术来敲除基因中特定片段，从而使该基因失活。很多时候人们管这个叫“基因编辑”。不过说实话，假设基因组是一本书的话，烧掉书中的一页并不能叫做“编辑”了这本书。

当很多人试图利用Cas9进行基因编辑的时候，Cas9会在DNA上形成一个断口，这个断口一般会被修复通路直接连接起来（error-prone），这样就造成了敲除的效果。但如果想重写相应的基因片段，就不太方便了，因为这通常依赖需要模板的修复通路（比如Homologousrecombination），在生物体中发生的频率并不高。

今年4月的一个工作带来了一些进展[3]。在该工作中，作者使用了一种改造的Cas9，可以结合到DNA上，但不能切割。这个酶上连接了一个胞苷脱氨基酶（Cytidinedeaminase），可以在Cas9结合DNA，打开双链后，将邻近基因序列中的C改成U，从而使得对应位置的碱基信息，由G-C，变成A-T。

不过可以想象，由于Cas9和Cytidine deaminase之间的linker是有弹性的，所以该方法不能对碱基进行精确的编辑。换句话说，只能把基因之书某个位置的前后几句话改写（你也不知道是几句）。

Argonaute家族

这就包括韩老师之前提出的NgAgo。这些蛋白的好处是不需要位点附近有PAM序列，也不需要sgRNA。不过原来大家认为它们的工作条件比较特殊（毕竟来自嗜热菌和嗜盐菌），不知道能不能找到合适的。目前关于NgAgo还没有定论，也不排除该家族有其他合适的备选。

其他

还有很多体系，大家用了很多年，进展也不大。比如丘奇（Church）的实验室，原来想找基因编辑的酶，就没找到CRISPR，反而找到一个叫lambda Red的东西。也能进行DNA操作，不需要sgRNA，只不过只能在细菌中用。。目前张峰和丘奇也在尝试其他不同的选择，包括整合酶以及重组酶。用这两个酶比较多的，其实是MIT的Timothy Lu。