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流体环境下的细胞培养影响RNA-binding protein quaking(QKI)表达

摘要: 细胞流体实验-流动状态的细胞培养影响RNA-binding protein quaking(QKI)表达 内皮层的细胞与细胞间的联系对于其发挥正常的生理作用有非常重要的作用。细胞间联系不仅 ...
细胞流体实验--流动状态的细胞培养影响RNA-binding protein quaking(QKI)表达

内皮层的细胞与细胞间的联系对于其发挥正常的生理作用有非常重要的作用。细胞间联系不仅会影响包括囊泡的释放和白血球渗出，并进一步影响血管生成过程。荷兰的科学家发现RNA-binding protein quaking(QKI)表达收到流动状态的细胞培养环境的影响。流动刺激下，其表达时间变长，并且转录因子KLF2会结合到其启动子上。进一步，科学家们发现quaking会直接和VE-cadherin和β-cadherin的mRNA相结合，并且能通过3’UTR直接诱导mRNA的翻译。

科学家们将HUVECs种在通道载玻片上，并且为其提供10dyne/cm2的持续的剪切力，进行长达7天的培养。之后，科学家们分析流体剪切力处理后的细胞表达的RNA并且直接对其进行免疫荧光染色。

一、实验准备实验材料及设备
1）细胞： HUVECs
2）试剂： 3.7% formalin （Millipore）
          0.5% Triton X-100 （Sigma-Aldrich)
          Hank’s Balanced Salt Solution containing Ca2+ and Mg2+   （HBSS Gibco）
3）培养耗材：ibidi六通道载玻片μ-Slide VI0.4 Luer （ibidi，Germany，80606）
             灌流管，15cm，1.6mm直径（ibidi，Germany，10962）
             串联管（ibidi，Germany，10830）
             封口夹
4）仪器设备：ibidi流体剪切力系统，含空气泵（ibidi，Germany，10905）和流体单元（ibidi，Germany，10903）

二、实验方法
在实验开始前一天，请将所有需要使用的试剂，培养基，通道载玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培养箱中放置过夜，排除由于温度差产生的微量气泡。

一）培养细胞
准备HUVECs，按照常规细胞培养方法进行培养。最好使用比较健康的内皮细胞，以防在做流体实验时候细胞不能稳定贴壁。

按照下面流程铺细胞：
1）按细胞密度为1.5* 10 6 cell/ml 铺细胞，注意，将移液器头插入注液孔中再加入细胞悬液，可以轻微倾斜通道载玻片帮助细胞悬液充满整个通道。
2）盖上注液孔盖，将通道载玻片放入细胞培养箱中培养半小时，等待细胞贴壁。细胞贴壁后，拿出通道载玻片，在每个注液孔中分别加入60μl培养基，注意，枪头要悬在孔上方滴入培养基。
3）将通道载玻片再放入二氧化碳培养箱进行培养3小时左右，等到细胞刚刚长满为单细胞层，即可开始实验。注意，要使用单层细胞进行剪切力实验，使每个细胞均受到均匀的剪切力。

二）搭建流体系统
        压力        剪切力        流速        持续时间
1）        50mbar        None（no slide)        23.4ml/min        不限
1）将灌流管按照说明放在置在流体单元上。在灌流管的储液管中分别加入8ml培养基。这时不需要连接通道载玻片。实验前需要去除整个灌流管中的气泡，存留在灌流系统的气泡会影响剪切力的大小，有时还会使灌流系统中的液体流动停滞。打开ibidi泵控制系统，在任务栏中找到“Remove air bubbles”，ibidi流体剪切力系统将自动运行下面任务，用于去除气泡。


（表一）

2）连接通道载玻片。使用串联管，将通道串联起来。这样可以在同一个条件，同一种液体的刺激下培养不同的样本。

在细胞贴壁后，将串联管如如图示插入串联管

在每一个注液孔中加满培养基，要注意不能把气泡加入在注液孔中。

用1ml的无菌注射器吸满培养基，小心插入如图的孔中，不要引入气泡。

小心推入培养基，直到第一个串联管有培养基微微冒出。

小心的将串联管弯过来，插入相邻的注液孔中。不要产生气泡。

继续推动注射器，直到第二根串联管也被充满，继续推动注射器充满下一根串联管。

重复上面的操作，继续充满所有的通道和串联管。

将所有的串联管连接好后，将加满液体排除气泡的灌流管用封口夹夹住。

小心将灌流管的一个鲁尔接头从联通管中拔出，插入最后一个注液孔中。

小心将注射器移除，在注液孔中加满培养基，将灌流管的另一个接头插入。

串联灌流系统搭建完成。

3）流体剪切力实验及免疫荧光实验  实验组细胞受到稳定的10dyne/cm2 刺激。持续培养7天，并在第一天和第四天更换全部培养液。整个系统一直置于37℃，5% CO2培养箱中培养。培养好的细胞用3.7% formalin固定10分钟并用Triton X-100通透2分钟。在使用含1%BSA和HBSS溶液封闭1小时后分别加入一抗二抗染色。

三 实验结果


在流体剪切力刺激下的内皮细胞中OKI上调表达。如图所示，a)RT-PCR 检测的在静置培养和流动培养的HUVEC中提取的Klf2和Nos3的mRNA的量。b）免疫荧光染色显示两种培养条件下HUVEC中的NOS3（绿色）或 VE-cadherin（绿色）和细胞核（蓝色）或F-actin（红色）。c）两种培养条件下HUVEC细胞中 Qki5，Qki6和Qki7的RT-PCR结果。d）两种培养条件HUVEC中提取的蛋白的免疫印迹对比。e) 两种培养条件下HUVEC细胞中 Qki5，Qki6和Qki7的免疫荧光（绿色）检测结果。

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