移动客户端学术搜索

医学实验外包/酵母双杂交实验

 找回密码
 加入晓木虫

QQ登录

微信登录

晓木虫»基因科学»医学实验外包/酵母双杂交实验
[基因科学]

医学实验外包/酵母双杂交实验

中洪博元 发表于 2016-7-29 16:54  
查看: 179726|回复: 13|
          深圳中洪博元生物技术有限公司  因为专注,所以专业。

开始做酵母双杂交了,计划用一个膜蛋白去筛库,已经做好了工作量大,而预期结果要靠点小运气的心理准备,面前真是一条很长的路要走!
在丁香园学习了很久,希望能将我这次试验过程中遇到的困难和思索记录下来,跟大家一同讨论,共同学习。
今天先说说实验之前的试剂准备,为了保证实验能顺利进行,我选择了clontech的matchmaker gold系统,订购了人脑cDNA文库(标准化的),还有培养基也是订的商品化的,再有一个提酵母质粒的KIT

1,GOLD系统式对系统3的升级版,替换了一个报告基因,新加入了一种新的真菌抗生素,可能叫金担子素A吧,降低了平板的背景,和假阳性结果。 另外系统自带了一个转化酵母的试剂盒。
2,人脑cDNA文库,标准化的意思是降低了很多管家基因的表达水平,这样一来库内的各种基因表达水平比较均等,我是这样理解的,这个文库一共5支,每支1ml,每筛一次就要用去一支,还是很珍贵的。打了85折下来,也要10000块左右。
3,培养基用的很快,但是因为第一次接触酵母,为了保险起见,也咬牙买了

这么多的前期准备,花了大概25000的样子,都是打了85折

整体实验外包

对照试验
东西到了之后,首先打算做对照试验
pGBKT7-53 + pGADT7-T 作为阳性对照
pGBKT7-Lam+pGADT7-T 作为阴性对照
(高压培养基的时候,没有预先打听清楚,高压条件,就跟普通LB一样送到高压室去了,结果高压时间过长,导致葡萄糖深度焦化,YPDA变成了很深的酒红色,只好重新再来。损失呀!!!!第二次,严格按照说明书自己高压 121° 15min,可是结果颜色看起来还是有那么一点发红,硬着头皮用于转化,结果有转化子长出来,只是转化效率很低,打算下次115° 20min 试一试)
从-80°取菌种,划线,30° 培养3天,长出了很多克隆。酵母的克隆与大肠杆菌克隆相比,更大,乳白色,看起来表面光滑而湿润,把平板用封口膜封好,4°冰箱保存,防止霉菌污染。

第一次尝试转化实验,转化效率不高,T(SD/-Leu)1:10长出大概不到50个克隆,而另外两个质粒的转化子更差,还有个奇怪的现象,2天的时候克隆直径不到2MM,还是乳白色的,长到第3天后居然变成粉红色的了,有的板红色的程度更深一些

查资料,考虑有2个原因:1,长的时间太长,菌种老化了
2,培养板上的Ade含量不足,产生了代谢产物是粉红色的
重复转化一次再看看
下次的改进:感受态的制备过程更注意无菌操作,冰水浴上进行,同时用感受态涂YPDA平板,以验证感受态细胞的质量如何

另外筛库用的重组质粒也在同步构建

深圳中洪博元生物技术有限公司  因为专注,所以专业。

医学实验外包/酵母双杂交实验
陆仁炳 发表于 2016-9-29 12:45  
论坛有你更精彩!
daluhaha 发表于 2016-9-29 14:22  
以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
zhaoliteng 发表于 2016-9-29 15:08  
好东西一定要看看!
你好岁月 发表于 2016-9-29 16:04  
好东西一定要看看!
AE筱溪 发表于 2016-9-29 16:56  
好东西一定要看看!
昆吾慕南 发表于 2016-9-29 16:57  
谢谢您的分享!
孤山野 发表于 2016-9-29 18:01  
论坛有你更精彩!
doudou 发表于 2016-9-29 18:36  
大家都不容易!
玫瑰之泪 发表于 2016-9-29 21:53  
以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
gxrshoulderknee 发表于 2016-9-30 04:58  
好东西一定要看看!
暴暴昂 发表于 2016-9-30 08:04  
好东西一定要看看!
xiaojuan 发表于 2016-9-30 09:37  
以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
你好岁月 发表于 2016-9-30 14:24  
谢谢您的分享!
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入晓木虫

本版积分规则  | 请遵守晓木虫学术科研第一站管理条例,不得违反国家法律法规

Copyright © 2014-2022 晓木虫学术科研第一站(emuchong.com)All Rights Reserved.

公安备案:京公网安备11010802030280号

     

ICP备案/许可证号:京ICP备19032535号-4

     

跟帖评论自律管理承诺书

      

优质科研网站 | 优秀信息互联网站

     © 2014-2022 晓木虫 版权所有

网上有害信息举报中心      京作登字-2019-F-01042692      晓木虫® 小木虫®第41764267号
返回顶部