晓木虫首页学术数据库客户端
开启辅助访问 设为首页赞助得金币注册指南网站导航

 找回密码
 注册账号

QQ登录

微信登录

慢病毒生产方案

摘要: 一、材料和试剂1. Hairpin-pLKO.1vector（OpenBiosystems）2. Packagingvectors:第二代包装质粒包含gag,pol,和rev基因（pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2）和包被质 ...
一、材料和试剂
1.  Hairpin-pLKO.1vector（OpenBiosystems）

2.  Packagingvectors:第二代包装质粒包含gag,pol,和rev基因（pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2）和包被质粒（pMD2.G）（Addgene）

3.  脂质体2000（Invitrogen）

4.OptiMEM无血清培养基（Invitrogen）

5.  293T包装细胞（ATCC）

6.  DMEM（Invitrogen）

7.  胎牛血清（Invitrogen）

8.  青/链霉素（Invitrogen）

9.  6 cm 细胞培养皿（Fisher）

10.  45 um 过滤器（Fisher）

二、仪器
1.  细胞培养箱

2.  离心机


三、实验步骤
1.  6 cm 细胞培养皿中种植293T细胞，细胞密度为1.3~1.5×105，每孔体积6 ml。

2.  孵育细胞24 h（37℃，5%CO2），或者孵育至第二天下午。约24 h 后，细胞融合度应该达到了70%。

3.  转染包装细胞:
（1）准备含有3种转染质粒的混合物
900 ng 包装质粒
100 ng 包被质粒
1 ug pLKO.1质粒
10~30 ul OptiMEM培养基

（2）用OptiMEM稀释脂质体2000：10 ul 脂质体+90 ul OptiMEM。逐滴滴加脂质体试剂，通过颠倒旋转或者轻弹管子来混匀，（不能用移液器或者涡旋来混匀），室温下孵育5分钟。

（3）向稀释的脂质体中逐滴滴加上述3种质粒混合物，颠倒旋转或者轻弹管子混匀。

（4）室温下孵育转染混合物20~30分钟。

（5）小心将转染混合物移入包装细胞的培养液中。包装细胞对外源干扰非常敏感-小心不要让细胞从板上脱落。每板需要转染混合物的总体积为100~125 μL。

4.  孵育细胞18 h（37℃，5%CO2），或者直到第二天早上。

5.  更换培养液以去除转染试剂，为了进行病毒收获更替为6 mL 的收获培养液。

6.  孵育细胞24 h（37℃，5%CO2）。

7.  在转染约40 h 后收集含有慢病毒的培养液。将培养液移入储存管中。替换为6 mL 的收获培养液。

8.  每12~24 h 重复上述病毒收获过程，并且替换为6 mL 的收获培养液。病毒滴度在收获过程中会逐渐的减弱；通常总共收集2~3个时间点的病毒。最后一次收获之后,丢弃包装细胞。病毒收获物可以按需要进行合并。

9.  1250 rpm 的转速旋转包含病毒的培养液5分钟，使得在收获过程中所收集的包装细胞变成球状。将上清液通过45 um 过滤器，然后移入无菌储存管中。

10.  病毒在4℃可以保存时间较短（数小时到数天），但是在-20℃或在-80℃可以冻存较长时间。为了减少冻结/解冻的次数，在长期储存之前，需将大量的病毒产品分装入小的储存管中。
       中洪博元生物技术有限公司。因为专注，所以专业。

慢病毒生产方案
评论

举报

谢谢您的分享！
评论 支持 反对

举报

论坛有你更精彩！
评论 支持 反对

举报

谢谢您的分享！
评论 支持 反对

举报

大家都不容易！
评论 支持 反对

举报

以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
评论 支持 反对

举报

谢谢您的分享！
评论 支持 反对

举报

大家都不容易！
评论 支持 反对

举报

好东西一定要看看！
评论 支持 反对

举报

以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
评论 支持 反对

举报

以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
评论 支持 反对

举报

论坛有你更精彩！
评论 支持 反对

举报

好东西一定要看看！
评论 支持 反对

举报

以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
评论 支持 反对

举报

论坛有你更精彩！
评论 支持 反对

举报

好东西一定要看看！
评论 支持 反对

举报

论坛有你更精彩！
评论 支持 反对

举报

论坛有你更精彩！
评论 支持 反对

举报

谢谢您的分享！
评论 支持 反对

举报

以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
评论 支持 反对

举报

返回顶部