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Aquat Toxicol台师大林豊益:NMT检测抗癌药对活体斑马鱼泌酸及神经丘生理功能影响评价

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[成果与文献分享]

Aquat Toxicol台师大林豊益:NMT检测抗癌药对活体斑马鱼泌酸及神经丘生理功能影响评价

 楼主| xuyue_2017 发表于 2021-1-28 15:17  
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本帖最后由 xuyue_2017 于 2021-2-1 15:05 编辑

NMT作为生命科学底层核心技术,是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年,NMT已扎根中国15年。2020年,中国NMT销往瑞士苏黎世大学,正式打开欧洲市场。
基本信息

主题:NMT检测抗癌药对活体斑马鱼泌酸及神经丘生理功能影响评价其环境毒性
期刊:Aquatic Toxicology
影响因子:4.346
研究使用平台:NMT斑马鱼科创新平台
标题:Vincristine exposure impairs skin keratinocytes, ionocytes, and lateral-line hair cells in developing zebrafish embryos
作者:台湾师范大学林豊益、Giun-Yi Hung

检测离子/分子指标
Ca2+、H+(pH)

检测样品
H+(pH):斑马鱼胚胎皮肤离子细胞
Ca2+:斑马鱼胚胎L1神经丘(侧线毛细胞)

中文摘要(谷歌机翻)

抗癌药物对环境的污染已得到广泛报道。这些药物不易生物降解,在世界各地的地表水和地下水中都发现了它们的母体化合物和/或代谢物。抗癌药物的不良反应经常发生在癌症患者身上,并已积累了大量的临床知识。然而,这些药物对水生生物的影响尚未得到彻底研究。本研究旨在探讨急性暴露于一种常见的抗癌药物—长春新碱(VCR)对斑马鱼胚胎发育和皮肤功能的影响。VCR暴露96 h后(0、1、10、15、25 mg/L),观察到明显的致畸作用,包括生长迟缓,心包水肿,脊柱、尾巴和卵黄囊畸形(VCR≥15 mg/L),心率下降,眼部畸形(VCR≥10 mg/L)。斑马鱼胚胎的半数致死浓度值为20.6 mg/L,当VCR≥10 mg/L时,全身离子含量和皮肤离子细胞的酸分泌减少,这些发现与皮肤离子细胞(富含H+-ATPase的细胞和富含Na+-K+-ATPase的细胞)的减少有关。另外,皮肤角质细胞的微脊结构也明显受损。当VCR≥10 mg/L时,侧线毛细胞数量减少,当VCR低至1 mg/L时,功能受损。这一斑马鱼胚胎体内研究结果表明,急性接触VCR可导致发育缺陷、皮肤功能损害,甚至鱼类死亡。

离子/分子流实验处理

斑马鱼在0、1、10、15或25 mg/L的长春新碱(vincristine,VCR)中孵育96 h

离子/分子流实验结果

将H+流速微传感器放置在斑马鱼胚胎皮肤离子细胞表面以检测[H+]梯度变化(图1D)。测得的[H+]梯度变化代表胚胎皮肤分泌酸的情况。用不同浓度的VCR(0、1、10、15和25 mg/L)孵育受精后96 h(96 hfp)的斑马鱼,[H+]梯度在用10、15和25 mg/L VCR孵育的胚胎中逐渐降低(图1E)。
图1. 长春新碱对96 hfp斑马鱼胚胎酸分泌的影响
通过非损伤微测技术(NMT)检测胚胎L1神经丘的Ca2+内流速率(图2A)。图2B显示,与对照组相比,1 mg/L组的Ca2+内流速率减少了>20%(P <0.05)。Ca2+内流速率随着VCR浓度的增加呈剂量依赖性递减趋势,10 mg/L组的Ca2+内流速率减少了>60%(P<0.001),15 mg/L组的Ca2+内流速率几乎检测不到(P<0.001)。25 mg/L组的神经丘几乎完全消失,所以没有对该组进行测定。
图2.长春新碱对斑马鱼毛细胞Ca2+内流的影响

其他实验结果

  • 在用VCR处理斑马鱼0~96 h期间的半致死浓度(LC50)约为20.6 mg/L。
  • 在VCR暴露96 h后,≥10 mg/L时,斑马鱼胚胎的心率(每分钟)以浓度依赖的方式显著降低。
  • 随着VCR浓度的升高,发现其有明显的致畸作用,表现为进行性生长迟缓、眼部尺寸缩小、S形脊柱弯曲、尾端扭曲、卵黄囊水肿、心包腔增大。
  • 15和25 mg/L VCR孵育后斑马鱼胚胎体内Ca2+和K+含量显著降低;10、15、25 mg/L VCR孵育后Na+含量显著降低。
  • 10、15、25 mg/L VCR处理的胚胎HR(H+-ATPase rich)细胞数明显减少。15和25 mg/L VCR处理的胚胎NaR(Na+/K+-ATPase-rich)细胞数量明显减少。
  • 用扫描电镜观察胚胎皮肤角质细胞的形态。对照组角质细胞为多角形上皮细胞,膜上有“指纹”(微嵴)结构。10 mg/L组角质细胞的微嵴变得不完整,在15和25 mg/L VCR处理时被严重破坏或已消失。
  • 用扫描电镜观察不同浓度VCR孵育L1神经丘毛束形态。10、15和25 mg/L VCR处理的胚胎毛束形态呈渐进性变粗。10、15、25 mg/L组L1神经丘顶端面积有所下降。
  • 随着VCR浓度增加L1神经丘毛细胞数量逐渐减少至几乎完全消失。

结论

总之,VCR表现出致畸性,并可以诱导斑马鱼胚胎皮肤离子细胞功能损伤。为了证明VCR诱导的急性胚胎毒性,本研究引入了一种非经典的测量体轴畸形的方法,通过说明BL1、BL2以及BL1/BL2的比例,以更好地量化C型或S型的体轴曲率。在低至1 mg/L的VCR条件下,NMT可检测到体内侧线毛细胞的功能性损伤。当VCR≥10 mg/L时,对皮肤离子细胞和角质细胞的损伤可导致离子稳态失调、心包水肿和胚胎发育障碍。所有这些功能和形态变化都是在LC50水平以下发生的。使用扫描电镜能够可视化表皮VCR相关损伤的过程,并可能在皮肤损伤后重新上皮化。此外,NMT是检测上皮细胞包括侧线毛细胞和皮肤离子细胞功能改变的有力工具。这种斑马鱼动物模型可以在未来的生态毒理学研究中应用,以早期预测神经毒性药物污染物对鱼类的亚致死效应。

测试液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO4, 0.2 mM MgSO4, 0.16 mM KH2PO4, 0.16 mM K2HPO4, 0.1 mg/L tricaine, pH 7.0

仪器采购信息

据中关村NMT产业联盟了解,台湾师范大学生命科学系林豊益教授于2019年采购了旭月公司的非损伤微测系统。

关键词:酸分泌;胚胎;鱼;离子细胞;神经丘;皮肤

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