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北京林大陈少良:REM6.5 激活质膜质子泵促植物耐盐|NMT植物耐盐创新平台

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[成果与文献分享]

北京林大陈少良:REM6.5 激活质膜质子泵促植物耐盐|NMT植物耐盐创新平台

 楼主| xuyue_2017 发表于 2020-11-27 08:55  
查看: 22296|回复: 0|
NMT作为生命科学底层核心技术,是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年,NMT已扎根中国15年。2020年,中国NMT销往瑞士苏黎世大学,正式打开欧洲市场。


基本信息
主题:REM6.5 激活质膜质子泵促植物耐盐
期刊:Tree Physiology
影响因子:3.477
研究使用平台:NMT植物耐盐创新平台
标题:Populus euphratica remorin 6.5 activates plasma membrane H+-ATPases to mediate salt tolerance
作者:北京林业大学陈少良、张会龙

检测离子/分子指标
Na+,H+,K+

检测样品
7日龄拟南芥(WT和转基因)根分生区(距根尖200µm根表上的点)


中文摘要(谷歌机翻)

Remorins(REM)在植物适应不利环境的能力中起着重要作用。PeREM6.5是胡杨,耐盐杨树中REM家族的一种蛋白质,是由愈伤组织,根和叶中的NaCl胁迫诱导的。我们从胡杨假单胞菌中克隆了全长PeREM6.5,并将其转化为大肠杆菌和拟南芥。PeREM6.5重组蛋白显着提高了胡杨质膜(PM)囊泡中的H ATPase水解活性和H+转运活性。酵母杂交分析表明,胡杨REM6.5RPM1相互作用蛋白4(PeRIN4)相互作用。PeRI N4重组蛋白增强了PeREM6.5诱导的PM H+ -ATPase活性的增加,在拟南芥中PeREM6.5的正向表达在存活率,根生长,电解质渗漏和丙二醛含量方面显着提高了转基因植物的耐盐性。过表达PeREM6.5的拟南芥植物在体内和体外试验中均保持较高的PM H+ -ATPase活性。由于H+ -ATPases促进了Na的挤出,PeREM6.5转基因植物的Na积累减少,而且H+泵引起了血浆膜的每极化,降低了盐碱化根系PM中去极化激活通道介导的K+损失,因此,我们得出以下结论:帽子PeREM6.5调节了PM中的H+ -ATPase活性,从而增强了植物在盐度下保持离子稳态的能力。

离子/分子流实验处理方法

(1)125 mM NaCl处理12小时
(2)500 μM钒酸钠处理20分钟


离子/分子流实验结果

使用NMT技术,在低Na+测试液中记录了来自对照和盐处理植物根部的Na+外排。NaCl处理(12 h)导致所有测试株系的Na+外排显著增加(图1A)。转基因植物在NaCl处理后表现出比WT植物更高的Na+外排(图1A)。在所有测试株系中,NaCl均增加了K+的外排,但WT中的K+损失高于转基因植物(图1B)
图1

在NaCl处理下,H+由内流转为外排,转基因植物中的H+外排显着高于野生型植物(图2A)。但是,盐诱导的H+外排被质膜(PM)H+-ATPase的特异性抑制剂钒酸钠消除(图2A)。该结果表明盐诱导的H+外排是由H+泵活性增加引起的。H+外排在转基因植物中更为明显的事实表明,转基因植物在NaCl胁迫下仍具有较高的H+泵活性。

PeREM6.5-转基因植物的根在盐胁迫下表现出比野生型植物的根更高的PM超极化(-63±2 mV),尽管在无对照植物中膜电位相似(-82±3 mV;图2B)。膜电位越负,说明PM中的H+泵活性越高。

PeREM6.5-转基因拟南芥中分离的PM囊泡进行了PM H+-ATPase活性的体外测定。与野生型相比,转基因植物通常表现出更高的ATP水解活性(2.1倍;图2C)。因此,PeREM6.5上调了转基因株系中PM H+-ATPase的活性。这一发现与转基因拟南芥根系中H+转运活性增加的体内协调一致(图2A)。综上所述,PeREM6.5可以提高转基因拟南芥中PM H+-ATPase的活性。

图2




其他实验结果

  • 无论NaCl浓度如何,胡杨PeREM6.5在愈伤组织、根和地上部分均对NaCl胁迫有响应。
  • 从胡杨叶中克隆了PeREM6.5的cDNA全长1130bp。PeREM6.5氨基酸序列与populus trichocarpa(PtREM)的相似性高。结构分析预测PeREM6.5蛋白质是典型的Remorin-C结构域。
  • 共聚焦激光扫描显微镜结果表明,PeREM定位于PM和细胞质。此外,PeREM6.5与PM标记FM4-64部分共定位,表明PeREM6.5是与PM相关的蛋白质。
  • PeREM6.5与PeRIN4相互作用,提高胡杨PM H+-ATPase的酶活性。
  • 半定量逆转录PCR和RT-qPCR显示,OE2、OE15和OE21表达的PeREM6.5转录水平高于其他株系。
  • PeREM6.5过表达提高了拟南芥的耐盐性。
  • 盐处理(12h)显著增加了所有试验株系的根细胞内Na+浓度。然而,转基因株系中的Na+特异性荧光低于野生型。与盐渍化根相比,在对照条件下荧光强度几乎无法检测。



结论

基于我们的研究结果,我们得出结论:PeREM6.5介导了胡杨的H+泵活性。盐处理诱导了胡杨中REM6.5的表达,编码蛋白与PeRIN4相互作用,稳定了H+-ATPase复合物,从而提高了PM H+-ATPase的活性。因此,PeREM6.5-PeRIN4-蛋白复合物激活的H+-泵通过Ca2+-SOS途径促进Na+/H+反转运。此外,活化的PM H+-ATPase保留较少的去极化PM,限制K+通过DA-KORC和DA-NSCC外排。结果表明,盐碱环境下胡杨属植物保持了K+/Na+的动态平衡


离子流实验使用的测试液

0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8

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