活细胞染色观察&活细胞骨架染料

Actin-肌动蛋白是细胞骨架不可或缺的一个组成部分，其在很多最基础的细胞活动中扮演着非常重要的角色。尤其在细胞形态，迁移和研究细胞机制中，肌动蛋白都是一个非常理想的观测蛋白。肌动蛋白是由小球状的G-actin聚合成丝状的F-actin动态交互变化构成的，从而参与了细胞活动中的各种细胞骨架的变化。通常研究活细胞中actin的活动用的是转染actin-GFP融合蛋白的质粒，可以同时标记F-actin和G-actin，可以有效的反映出细胞骨架的相对活性，但是当值需要观测F-actin的时候，使用actin-GFP会降低信噪比，难以专一捕捉F-actin的活动。更有研究显示，使用actin-GFP会直接影响细胞迁移和细胞分裂中的肌动蛋白活性。

2015年英国的科研人员研究了几种可以标记F-actin染料发现LifeAct是一种观测F-actin非常理想的染料，其能特异性结合F-actin而不会影响肌动蛋白的活性，能够很好的显现出肌动蛋白的结构。LifeAct是一个17个氨基酸形成短肽，由于其很小，不会被哺乳动物细胞当作外来蛋白清除，从而使一个非常理想的F-actin标记物。文中，以人间充质干细胞（hMSCs， Human mesenchymal stem cells）为载体，研究LifeAct-GFP对比actin-GFP在观测肌动蛋白中的应用。

Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration

K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight

Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034

（一）实验材料

1) 细胞:     hMSCs            （STEMCELL Technologies，UK）

2) 试剂:    LifeAct-TagGFP2 质粒    （ibidi， Germany）

             DMEM             （Gibco）

             Actin-GFP

             Lipofetamine LTX Plus     (Invitrogen)

             4%多聚甲醛溶液

             0.5%Triton X-100

  3) 耗材：玻璃管（外径1mm，内径0.58mm）

（二）实验步骤

  1、LifeAct-GFP和 actin-GFP转染

l 使用未分化的hMSCs细胞转染actin-GFP质粒。

l 无抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培养细胞30min到1h

l 使用Lipofetamine LTX Plus转染质粒，按照说明书将细胞在转染培养基中培养6小时。

l 使用未分化的hMSCs细胞和，hMSCs细胞分化的永生化软骨细胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺病毒。

2、固定细胞的肌动蛋白结构

使用Alexa Flour555-phalloidin标记F-actin

l 单层细胞贴壁染色，是将已经用LifeAct-GFP和 actin-GFP转染的细胞，用4%多聚甲醛固定10分钟，再用0.5%Triton X-100通透5分钟，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分钟。

l 悬浮细胞染色，是将已经用LifeAct-GFP和 actin-GFP转染的细胞消化为单细胞，再在悬浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分钟，再用0.5%Triton X-100通透5分钟，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分钟。

3、微管吸吮技术

l 将外径1mm，内径0.58mm玻璃管拉为内径7-8μm的微管

l 使用注射泵维持微管内有0.76kPa的负压

l 轻轻吸取细胞，每2秒采集一张图片

l 细胞在微管负压情况下会有不规则的突起，进入微管，能很好的观测F-actin的活动。

（三）实验结果

1、鬼笔环肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP转染共定位（图一）

图一：鬼笔环肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP转染共定位：A、E）贴壁细胞中，LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在标记F-actin时都表现很好，但是在悬浮细胞中，C、G）虽然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼笔环肽都能共定位F-actin，但是actin-GFP在整个细胞中都有染色，因为其同时染G-actin没有凸显出F-actin。

2、微管吸吮技术使细胞发生形变，观察F-actin活动（图二）

图二：微管吸吮技术造成细胞形变。A）LifeAct-GFP可以很好的追踪F-actin，会根据细胞的形变，标记到细胞突起的最外缘的骨架；B）使用Actin-GFP标记没有特异性，不能看到细胞变形中最边缘的骨架。